Homeبرق و الکترونیکمقاله دستگاه HPLC و PCR چیست؟

مقاله دستگاه HPLC و PCR چیست؟

7,800تومان

دستگاه HPLC و PCR دو دستگاه آزمایشگاهی – پزشکی هستند که در این مقاله به هر دو این دستگاه ها پرداخته شده است. همچنین درباره کاربرد اصول طراحی و ساخت و ساختمان آن ها اطلاعات مورد نیاز و مفیدی به شما ارائه میدهد.

این مقاله با فرمت word و قابل ویراش در ۱۵ صفحه برای دانلود قرار داده شده است.

در ادامه بخشی از متن این مقاله را مشاهده می کنید.

توضیحات

دستگاه HPLC و PCR

PCRبه علت دارا بودن ویژگی وحساسیت بالا وسرعت وسهولت آن جایگاه ویژه ای درتحقیقات وتشخیصهای مولکولی پیدا کرده است.PCR درسال۱۹۸۳توسط دکترMullis ابداع شد،که جایزه نوبل شیمی رادرسال۱۹۹۳ دریافت کرد.

PCR در محیط آزمایشگاه(in vitro) امکان تکثیریک توالی معین ازDNAراکه بین دوتوالی مشخص قراردارد امکان پذیرمی کند تا DNA ازنظرمقدار به حدکافی برسد وبتوان روی آن آزمایشهایی مثل الکتروفورز-ژل آگارز- پلی اکریل آمید،هیبریداسیون باپروب راانجام داد.این روش ازنظرعلمی تشابه زیادی به همانندسازی DNA دارد.دکترMullis اولین بار ازآنزیمDNA پلیمراز اشریشیا کولی برای انجام PCR استفاده کرد.

کاربردPCR
تعین جنسیت جنین،تعیین ژنوتیپ اپیتوپهای پیوندی ،تعیین ژنوتیپ گروههای خونیABO ،تهیه نسخه های متعدداز یک ژن،تشخیص بیماریها واختلالات ژنتیکی ،تشخیص بیماریهای عفونی ،ردابوت وتعیین والدین مطالعات باستان شناسی ،تعیین انواع لوسمیها ،تولیدوطراحی واکسنهای انسانی ودامی ،پزشکی قانونی وانگشت نگاری،DNA ازروی لکه خشک شده خون ،درتشخیص HIV ،سل وبیماریهای مقاربتی.

درحقییقت این تکنیک می رود تا دراینده نتیجه گیری دادگاهها راتحت تأثیرقراردهد.

دانشمندان اکنون می توانند میکروارگانیسمهای غیرقابل کشتی راکه تا کنون نمی توانستند با روشهای کلاسیک میکروب شناسی مورد مطالعه قراردهند به کمک PCR مطالعه نمایند.

نمونه های مورداستفاده برای آزمایشگاه مولکولیPCR

طیف وسیعی ازمواد بیولوژیک ،لکه های خون،سرم،بزاق،منی ،مو ،مایع نخاعی ،استخوان، مایع آمنیون،سلولهای خودجنین درمرحله بلاستولا ،نمونه های بیوپسی ویا آتوپسی باشند هرچه آلودگی کمترباشد حساسیت ودقت نتایج بیشتر خواهد بود.

اصول وروشهای PCR

روش PCRبرمبنای سه روش ساده بنا شده که انجام این سه مرحله درهرواکنش سنتز DNA ضرورت داردکه با برنامه دادن به Thermocycler اجرا می شود وعبارتند از:

-۱مرحله Denaturation: دراین مرحله DNA هدف براثرحرارت تک رشته ای می شود،حرارت۹۰-۹۵ درجه سانتیگراد

-۲مرحله Annealing : دراین مرحله با کاهش حرارت سیستم ،پرایمرها درمحل مناسب روی رشته مکمل متصل می شوند ،دما۵۳-۷۵ درجه سانتیگراد، درمرحله Anneling بایددقت لازم بعمل آیدودما باید به درستی انتخاب شود این کار توسط کامپیوتر به طور مستقیم ویا توسط محقق وبا توجه به دانش فنی وتجربه صورت می گیرد اگردمای Annealing بدرستی انتخاب نشود احتمال تکثیر غیراختصاصی DNAوجوددارد به طوری که دردمای پایینتراز حداستانداردAmplication غیراختصاصی ودر دمای بالاتر ازمعمول عدم تکثیرDNA رخ می دهد.

-۳مرحله Extension : در این مرحله که دمای آن برای انزیم DNA پلیمراز مطلوب می باشد موجب توسعه پرایمرها شده وهمانندسازی DNA هدف انجام می گیرد.دما حدود۷۲ درجه سانتیگراد آنزیم مقاوم به حرارت Taq polymerase چهارتا نوکلئوتید dATP ، dGTP ،dTTP، dCTP موجود درمحیط وبافرهای PCR شامل Tris وپرایمرهای جفت شده به DNA را درحضورMgcl2 مورداستفاده قرار می دهد و واکنش پلیمریزاسیون را کاتالیز می نماید وسبب طویل شدن رشته DNA جدیدی که توسط پرایمر ساخته شده است می شود .

نتیجه چرخه سه مرحله ای فوق سنتز دو مولکول جدیدDNA است ،سنتز DNA جدید به صورت تصاعدی آنقدر ادامه می یابد تا اینکه یکی ازمواد تشکیل دهنده محیط واکنش کاهش یابد وغیرفعال شود. به طورکلی حدود۳۵-۲۵ سیکل کافی است تا ازمقدار بسیارکم DNA صدها هزارنسخه DNA سنتز گردد. ازنظرتئوری بعداز۲۰ سیکل ۱میلیون وبعداز ۳۰سیکل ۱میلیارد کپی حاصل می گردد.نکته ای که درمراحل مختلف PCR بایدمورد توجه قرارگیرد زمان لازم برای رسیدن ازیک دما به یک دمای دیگرکه زمان کوتاهی است (Ramping Time).


پارامترهای مؤثر در PCR

۱- زمان ودمای Denaturation بستگی به تعداد C و G دارد

۲- دمای Annealing پرایمرها که باید۴-۳درجه کمترازدمای ذوب پرایمرها باشد

۳- زمان Primer extension که به تعداد بازهای بین دوپرایمر بستگی دارد

۴- تعداد سیکلها

Ramp)-5زمانی که طول می کشد تا دمای مبدادستگاه به دمای مقصد برسد) هرچه این زمان کمترباشد نتیجه کاربهتراست و واکنش زمان کمتری دردمای ناخواسته قرار می گیرد

۶- غلظت dNTP ها ویون منیزیوم(اینها مجموعه ای راتشکیل میدهند که موجب فعالیت آنزیم پلیمراز می شوند وغلظت این دوماده تابعی ازیکدیگر می باشند(

۷- غلظت Template DNA (یک دهم تایک میکروگرم می باشد)چنانچه DNA هدف به صورت مالتی کپی درژنوم باشد بهتراست

۸- اضافه کردن تشدیدکننده های PCR

۹- حذف مهارکننده های آنزیم ازمحیط

۱۰- بهتراست نقطه ذوب پرایمرها شبیه هم باشد(Tm یکسان داشته باشند)

طراحی پرایمر:

پرایمرهای PCR به صورت کاملاً اختصاصی ومکمل ناحیه مورد نظرDNA هدف طراحی میگردند.پرایمرها ۳۰-۲۰باز دارندوپرایمرهای بیش از۳۰بازاختصاصیت خوبی ندارند.همچنین پرایمرها بایددمای انیلینگ بالا داشته باشند.بهتراست تعدادبازهای دو پرایمر مساوی باشند واز پلی پورین یا پلی پیریمیدین نباشند،همچنین نواحی تکرارشونده نداشته باشندچنانچه بازهای GیاC به صورت تکراری وپشت سرهم باشند پرایمربه صورت لوپ در می آید وعملاًسیستم کارنمی کند.نرم افزارهایی وجود دارد که طراحی پرایمر را انجام می دهند.بعداز طراحی پرایمربهتر است توسط نرم افزارهایی مانند Blast انها را چک نمود تامشخص شود که با چه ژنهای دیگر می توانند Anneal گردند.

دستگاه HPLC

کروماتوگرافی روشی است برای تشخیص و جدا سازی و اندازه گیری مواد

HPLC یعنی کروماتوگرافی مایع با فشار زیاد یا کروماتوگرافی مایع با کارکرد عالی است.

HPLC از دو فاز ثابت و متحرک تشکیل شده است. که فاز ثابت جامد و فاز متحرک مایع است.


اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه HPLC

۱- مخازن محلول

که در آنها فاز متحرک و یا محلول های شستشو دهنده ستون ریخته شده است.


۲- موتور یا پمپ:

چون ستونها نسبتا طویل و اندازه ذرات کم است. به این جهت قابلیت نفوذ کم می شود و برای این که محلول جریان داشته باشد باید فشار وجود داشته باشد. برای ایجاد فشار از پمپ ها استفاده می کنیم. پمپ فشاری حدود psi 4500 می تواند ایجاد کند و باید فشار آن ثابت باشد.

محلول توسط پمپ با جریان ثابتی بر روی فاز ثابت حرکت داده می شود. حداکثر جریانی که فاز متحرک می تواند داشته باشد ۲،۵ملی لیتر در یک دقیقه است. و نظر به نوع کاری که می خواهیم انجام دهیم فلو یا جریان فرق می کند. هر چه جریان کمتر باشد، فاصله پیک ها بیشتر است.

میزان فشار بستگی به جریان دارد وقتی جریان ml/min 0.8 است میزان فشار حدود psi 1500 می شود. میزان فشار بستگی به نوع ستون دارد حداکثر فشار مجاز Psi 3500 است. حداکثر تغییرات فشار Psi 100 است. حداکثر فلوریت Flow rate ، ml/min 2.5 است. پس پمپ، محلول را از مخزن می گیرد و با سرعت معین آن را بداخل دستگاه وارد می کند.

به دو روش می توانیم کار کنیم:

الف: روش ایزوکراتیک isocratic

اگر نسبت های مختلفی از فاز متحرک را در یک مخزن بریزیم و از همان مخزن فاز متحرک را برداشت کنیم از روش ایزوکراتیک استفاده کرده ایم.

ب: روش گرادیانت gradient :

اجزاء فاز متحرک در مخازن مختلف قرار دارند. دستگاه قابلیت این را دارد که خودش نسبت های مختلف را از مخازن برداشت کند، مثلا می خواهیم ازمخزن اول ۸۰ فیصد از مخزن دوم ۸ فیصد و از مخزن سوم ۱۲ فیصدبکشد و بعد نسبت ها را مخلوط می کند. از این روش وقتی استفاده می کنیم که نسبت های موردنظر را نمی دانیم و بخواهیم روش کارپیدا کنیم. ولی وقتی درصد فاز متحرک برای ما روشن شد می توانیم از روش ایزوکراتیک استفاده کنیم. فاز متحرک با جریان ثابتی بر روی ستون حرکت داده می شود.

حداکثر فلو یا جریان در این تجربه ml/min0.8 یا ۱ است. بعد از فعال کردن هر پمپ flow rate را از کم به زیاد کم کم بالا می بریم تا حدود ml/min  ۰٫۸ یا ۱ و می گذاریم حدود پانزده دقیقه یا نیم ساعت با فلوریت بالا کار کند و بعد فلوریت را به تدریج پایین می آوریم تا صفر و بعد پمپ را عوض می کنیم. یا دستگاه را خاموش می کنیم، فلوریت که بالا برود فشار هم بالا می رود. بعد از اتمام کار ستون را با محلول های شستشو دهنده می شوئیم. محلول های شستشو را در مخازن ریخته و پمپ ها را به ترتیب فعال می کنیم اول دستگاه را با آب و متیانول شسته و سپس با متیانول خالص می شوئیم. هر پمپ را که فعال کردیم باید ابتدا هوا گیری کنیم.

۳- انجکتر injector:

از سوزن های مختلف با ظرفیت های مختلف استفاده می کنیم. حجم تزریق ۳- میکرولیتر است. نمونه ابتدا وارد قسمتی بنام گارد کالوم یا پری کالوم می شود که محافظ ستون است، طول کاردکالوم حدو یک سانتی متر است. و جنس آن از فولاد ضد زنگ است، و ماده پرکننده آن از جنس ماده پرکننده ستون است. اگر ماده مورد تشخیص ناخالصی داشته باشد یا با ماده داخل ستون عملیه کیمیاوی ایجاد کند درگاردکالوم انجام می شود و به ستون آسیبی نمی رسد.

۴- ستون:

طول ستونهای دستگاه حدود ۳۰-۱۰ سانتی متر است. و جنس آن از فولاد ضدزنگ است. پرمصرف ترین ستون C18 ، ODS آکتا دسیل سیلان است، ستونها را پس از اتمام کار باید با محلولهای شستشو دهنده شست. اگر از بافرفسفات استفاده کردیم ستون را با آب و متیانول و بعد با متیانول خالص شستشو می دهیم.

فاز ثابت بصورت ذرات ریزی در داخل ستون قرار گرفته است که بر اثر چسبیدن و پخش شدن اجزاء نمونه و عبور فاز متحرک جداسازی انجام می شود. نمونه ابتدا وارد گاردکالوم و بعد وارد ستون می شود. ODS اکتا دسیل سیلان گروههای الکیل غیرقطبی زیادی دارد، فاز متحرکی که استفاده می کنیم اکثرا قطبی است. فاز متحرک و ماده پرکننده ستون از نظر قطبیت باید عکس هم باشند.

دستگاه HPLC و PCR
دستگاه HPLC و PCR
دستگاه HPLC و PCR
دستگاه HPLC و PCR
دستگاه HPLC و PCR
دستگاه HPLC و PCR
دستگاه HPLC و PCR
دستگاه HPLC و PCR
دستگاه HPLC و PCR
دستگاه HPLC و PCR
دستگاه HPLC و PCR
دستگاه HPLC و PCR
دستگاه HPLC و PCR
دستگاه HPLC و PCR
دستگاه HPLC و PCR
دستگاه HPLC و PCR

نقد و بررسی ها

هیچ دیدگاهی برای این محصول نوشته نشده است .

اولین کسی باشید که دیدگاهی می نویسد “مقاله دستگاه HPLC و PCR چیست؟”

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.